鎳Ni柱是大家在蛋白純化中,應用較多的一種純化柱料,屬于固定化金屬離子親和色譜中的一種,1975年由Porath等發(fā)明,其間不斷完善發(fā)展至今。
原理:過渡金屬通過與電子供體配基上,能與金屬離子相互作用的羧基或氨基的電負性元素(O,N),形成較穩(wěn)定的金屬螯合物。
在IMAC中,一個Ni2+有六個配位位點,被含有3,4或5個電子供體基團(配位位點)的螯合物固定在吸附劑上,而剩下未被占據的位點暴露于溶液中,能與組氨酸,半胱氨酸,和色氨酸的側鏈或組氨酸標簽的蛋白特異性結合。
鎳Ni柱的使用與保養(yǎng)
鎳Ni柱的洗脫通常采用競爭洗脫,先用低濃度的咪唑將雜蛋白和結合不牢的蛋白洗去,再用合適的濃度將目的蛋白洗脫。洗脫的先后順序與蛋白的結合能力相關。
1、對于一般的預裝柱,上樣前,樣品需要使用0.22μm/0.45μm濾膜進行過濾或者離心處理,以避免樣品中有細胞碎片等固體物質,堵塞柱子。
2、如果細胞裂解后非常粘稠,需考慮是否因為DNA、RNA這類核酸物質過多,需要加入核酸酶去除,以降低樣品粘稠度,提高上樣速度及洗脫效果。
3、柱子使用過程中,不能超過填料的壓力,以免填料被壓塌。
4、每次使用后,可使用5-10倍柱體積的純水或者結合緩沖溶液對柱子進行清洗。(如果出現(xiàn)載量嚴重下降或者壓力增加,需考慮徹底清洗)